一、目的
掌握 Folin 一酚法测定蛋白质含量的原理方法，熟悉分光光度计的操作。
二、原理
Folin 一酚法测定蛋白质含量的过程包括两步反应：**步是在碱性条件下蛋白质与 Cu 2 +
作用生成络合物，**步是此络合物还原 Folin
试剂（磷钼酸和磷钨酸试剂），生成深蓝色的化合物，且颜色深浅与蛋白质的含量成正比关系。该方法灵敏度高于双缩脲法
100 倍。硫酸铵、甘氨酸、还原剂如二硫苏糖醇（ DTT ）、巯基乙醇等会干扰反应。
三、仪器与试剂
1 .仪器
（ 1) 分光光度计
（ 2 ）水浴
（ 3 ）试管
（ 4 ）具塞试管 8 支
（ 5 ）小烧杯 2 支
（ 6 ）漏斗及架
（ 7 ）分析天平
（ 8 ）吸管： 0 . 5m1 X 1 ， 1m1X2 ， 5m1 X 1
（ 9 ）容量瓶： 100m1 X 2 ， loml X 1
（ 10 ）滤纸、玻棒等
（ 11) 研钵
（ 12 ）离心机、离心管
2 .试剂
（ 1 ） 0.5mol/ L NaOH
(2) 试剂甲
1) 称取 1Og Na2C03 , 2g NaOH 和 0.25g 酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至
500m1 。
2) 0. 5g 硫酸铜 (CuS0 4 • 5H 2 O) 溶解后，用蒸馏水定容至 100m1 。
每次使用前将 A 液 50 份与 B 液 1 份混合，即为试剂甲。此混合液的有效期
只有 1 天，过期失效。
(3) 试剂乙：在 1.5L 容积的磨口回流器中加入 100g 钨酸钠 ( Na 2 WO 4 .2H 2 0
）， 25g 钼酸钠（ Na 2 Mo 4 .2H 2 0 ）及 700m1 蒸馏水，再加 50m1 85
％磷酸， 100m1 浓盐酸充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流 10h, 回流结束后，加入 150g 硫酸锂，
50ml 蒸馏水和数滴液体溴，开口继续沸腾 15min
，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色（若仍呈绿色，须再重复滴加液体溴数滴，再继续沸腾 15min ）。然后稀释至
1L ，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时大约加水 1 倍，使*终浓度相当于 1 mol ／ L 盐酸。
3 .材料
绿豆芽或其他植物材料。
四、操作步骤
1 .标准曲线的绘制
(1) 配置标准牛血清白蛋白溶液：在分析天平上**称取 0.025g
结晶牛血清白蛋白，倒至小烧杯内，加入小量蒸馏水溶解后转入 100m1
容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶内，*后用蒸馏水定容至刻度，配制成标准蛋自质溶液，其中牛血清白蛋白的浓度为
250 ug/ ml 。
(2) 系列标准牛血清白蛋白溶液的配制：取具塞试管 6
支，按下表加入牛血清白蛋白
标准溶液及蒸馏水。然后各管加入试剂甲 5ml ，混合后在室温下放置 10min ，再加
0.5ml 试剂乙，立即混合均匀（这一步速度要快，否则会使显色程度减弱）。 30min 后，以不含蛋白质的 1
号试管为对照，与其他 5 支试管内的溶液依次用分光光度计于 5OOnm 波长下比色。记录各试管内溶液的吸光度。
试剂 1 2 3 4 5 6
250ug/mg 牛血清蛋白（ ml ） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
H 2 O (ml) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
蛋白质含量（ ug ） 0 50 100 150 200 250
(3) 标准曲线的绘制：以吸光度为纵标，以牛血清自蛋白含量（ ug ）为横坐标，绘制标准曲线。
2 .样品测定
（ 1) 称取绿豆芽下胚轴 1g 于研钵中，加蒸馏水 2m1, 匀浆。转入离心管，并用 6m1
蒸馏水分次洗涤研钵，并入离心管。 4000r/min 离心 20min. 弃去沉淀，上清液转入容量瓶，定容至
10m1.
(2) 取具塞试管 2 支，各加入上清液 l ml, 分别加入试剂甲 5m1, 混匀后放置 lomin
，然后加试剂乙 0.5 ml ，迅速混匀，室温下放置 30min ，于 500nm 波长下比色，记录吸光值。
五、结果处理
从标准曲线上查出测定液中蛋白质的含量 X （ ug ），然后计算样品中蛋白质的百分含量。
六、注意事项
Folin 试剂（试剂乙）在碱性条件下不稳定，但此实验中反应在 pH 10 时发生，因此在 Folin
试剂反应时应立即混匀，否则显色程度减弱。
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