1. 如何将不同构型的质粒DNA区别开？
答：由于不同构型的DNA在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率不同，ccc DNA的泳动速度*快，通过凝胶电泳方法可将不同构型的DNA区别开。
2.用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？
答：异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
3.用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？
答：用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。
4.在提取RNA时经常使用异硫氰酸胍，有什么作用？
答：RNA是一种极易降解的核酸分子。高浓度强变性剂异硫氰酸胍使细胞结构迅速被破坏，使RNA从细胞中释放出来。同时高浓度异硫氰酸胍还使细胞内的RNA酶失活，使释放出的RNA不被降解。
5.蛋白印迹中封闭液的作用？
答：封闭液的作用是封闭未吸附蛋白的部位，以减少非特异性结合背景的影响。常用的封闭液有脱脂奶粉、小牛血清等。
6$DNA通常保存在什么缓冲液中？
答：采用TE缓冲液，Tris-HCl的缓冲系统，加入EDTA可以螯合二价金属离子进而抑制依赖于二价金属离子的DNA酶的活性，对DNA起到保护作用。
7$在酶切反应缓冲液中为什么加入BSA？
答：通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。
8$简单的克隆载体必需包括什么？
答：复制起点；选择标记：主要是抗性基因；多克隆位点：便于外源DNA的插入。
1.用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性。
2.在分离DNA时，要使用EDTA，为什么？ EDTA是金属离子螯合剂，螯合二价离子，抑制核酸酶的活性。
3.在分离DNA过程中，造成DNA分子断裂的因素有哪些？核酸酶降解；化学降解；物理剪切。
4.使用离心机应注意什么？
首先应该根据自己的实验需求选择合适的离心机和转子以及离心管，使用离心机时的工作转速不应该超过离心机、转子以及离心管的*大允许转速。离心前注意严格平衡样品。安装转子和转子盖要规范、准确。离心时要留人看守，发现离心机异常应立即关闭离心机。离心结束后要安放好转子。
5.分子生物学实验室常用的**方法有哪些？
高压蒸汽**、干热**、化学药剂**、过滤**。
垂直吸液、慢吸慢放；选择合适的量程范围，不能超过量程使用；选择与移液器匹配的枪头，安装枪头时不要用力太猛；移液器每日用完后，应旋到*大刻度
7．为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚？呈粉红色的酚可否使用？如何保存酚不被空气氧化？
因为酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。
保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉红色的，这样的酚容易降解DNA，一般不可以便用。为了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羟基喹琳至终浓度为0.1％。8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金属离子的弱螯合剂。用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚，*好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子为宜，如有可能，可充氮气，防止与空气接触而被氧化。平时保存在4℃或－20℃冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。
8．抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？
酞与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在*下层。
作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果*好。经酚**次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿**次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在**次抽提时，将酚与氯仿混合(1:1)使用。
9．为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？
在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1(不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成)，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。
10．为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？
在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统(pKa＝7.2)和硼酸系统(pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2＋产生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl(pKa=8.0)的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。
1.电击杯为什么要放在冰上？感受态细胞也要放在冰上？
感受态细胞是指细胞容易吸收外源DNA的状态，这时的细胞壁是比较脆弱的，在实验前该细胞是放在-80度冰箱的，如果感受态细胞的温度骤然升高，那么细胞会膨胀破裂。冰为细胞提供了一个温度缓慢升高的过程，所以电击杯，感受态都要放在冰上。
2.载体的抗性基因是什么？平板上有什么？
载体的抗性基因是抗性基因bla，该基因特异性表达β-内酰胺酶，可以裂解***的β-内酰胺环。在平板上是含有氨苄青霉素的，只有相应的含有bla基因并能表达产生β-内酰胺酶的菌才能存活。从而达到有目的筛选的目的。
3.电转与钙转的区别是什么？二者各有什么优缺点？
1）电穿孔法：靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞。
优点：转染效率较高
缺点：需要昂贵的仪器（电穿孔仪）；对细胞的损伤较大，每次转染需要更多的细胞和DNA；每种细胞电转的条件都需要进行多次优化。
2）磷酸钙共沉淀法：磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面结合，氯化钙+DNA+磷酸缓冲液按一定的比例混和，形成极小的磷酸钙-DNA复合物沉淀黏附在细胞膜表面，借助内吞作用进入细胞质。沉淀颗粒的大小和质量对于转染的成功至关重要。
优点：能用于任何DNA导入哺乳类动物，瞬时转染和稳定转染。
缺点：转染效率低：进入细胞的DNA只有１％－５％可以进入细胞核，其中只有不到１％的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达。
重复性不佳：pH值、钙离子浓度、DNA浓度、沉淀反应时间、细胞孵育时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响。
4. 为什么在电转完毕之后，要把菌加到SOC中培养，而不是加到LB培养集中培养？
SOC的成分中含有单糖和丰富的无机盐离子，在LB培养基中含有酵母膏、蛋白胨等复杂的有机物。在刚刚转化完的**细胞内还没有完整的酶系统，不能利用复杂的有机物，所以要加SOC。
5. 电击时间是多少？电压为多少？
电击时间一般在4-6ms, 电压是1.8KV.
6.为什么要擦干电击杯上的水？
因为电击杯在电转之前是放在冰上的，上面粘上了水。如果不擦净电击杯上面的水会造成短路，达不到电击转化的效果。
7.为什么涂板培养之后，如果出现单菌落那么涂布就是成功的，而连成一片就是失败的？
因为单菌落就是单克隆，整个菌落的**都是一个**繁殖得到的，它们的遗传信息是相同的，这些菌要么都是阳性克隆，要么都是阴性克隆。如果连成一片之后，遗传信息不能保证完全一致，那么就无法鉴定是阳性克隆还是阴性克隆。
8、琼脂糖电泳如何进行鉴定质粒DNA.
多数情况下你能看到三条带，这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和线性。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。 非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7－10条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。
9、传统的质粒提取方法步骤是什么
溶液Ⅰ：（50 mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris.HCl pH8.0,10 mmol/L EDTA）
溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH，2%SDS用前等体积混合
溶液Ⅲ ：5 mol/L KAc 溶液60ml， 11.5 ml冰醋酸，28.5 ml 去离子水。
溶液I—溶菌液：
葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA：(1)螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用(DNase作用时需要一定的金属离子作辅基)在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
溶液II－NaOH－SDS液：裂解细胞，变性DNA.
NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。
SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：(1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。(2)解聚细胞中的核蛋白。(3)SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中(用RNase去除RNA时)受到干扰。
溶液III--3mol／L NaAc(pH4.8)溶液：使溶液回复中性，将基因组DNA、蛋白质等沉淀。
NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
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