逆转录病毒载体介导DNA转染技术
逆转录病毒载体简介
逆转录病毒载体属RNA病毒，但可在受染细胞内逆转录产生DNA互补链，此DNA单链可作为模板合成**条DNA链，**条DNA链可掺入细胞基因组DNA中。此病毒可利用宿主细胞的酶自行转录与复制，RNA可合成蛋白，再包装病毒，RNA从胞内释放，成为感染性病毒，该载体可经不同方式改变。介导过程可使病毒单拷贝基因组稳定地进入细胞。
首先，逆转录病毒的繁殖必须要有适当的包装细胞系，以利于产生高滴度的病毒，同时还具有适当的结构。如：ψ2（**代包装细胞），PA317（**代包装细胞），ψ1-CRIP、PG13、DA、CFA（第三代包装细胞），包装细胞可提供逆转录病毒gag、pol和env蛋白才能使带有包装信号及目的基因的病毒载体RNA进行包装，包装细胞只提供gag、pol和env蛋白而不产生具有复制能力的野生型病毒（RCR），而**代包装细胞可产生 RCR，**性较差；**代包装细胞，临床上已广泛应用，也未发现产生RCR，**性好；第三代包装细胞更加**，第三代包装细胞中主要区别是病毒结构基因中env不同。
逆转录病毒作为基因转移的载体有如下特点：
(1) 逆转录病毒感染细胞的效率高，基因转移率在10%-100%；
(2) 病毒基因转移能将外源基因整合到宿主细胞基因组中外源基因能稳定存在而不丢失；
(3) 外源基因整合的拷贝数一般只有一个；
(4) 逆转录病毒只选择感染分裂细胞；
(5) 病毒可容纳外源基因的DNA长度为<8Kb。
逆转录病毒载体的结构：已切除了病毒的结构基因gag，大部分pol和env，包括两侧的LTR，被选择（标记）基因和目的基因插入的多聚位点所取代，同时还带有包装信号ψ。
可产生特异性逆转录病毒细胞系的建立
(一) 逆转录病毒载体进入包装细胞系
从细胞质粒中产生感染性病毒包括将质粒导入包装细胞系，可从稳定感染细胞中选择病毒产生细胞或用一个包装细胞系暂时产生的病毒感染另一种有不同包装的细胞系，从中选择病毒的产生细胞。
1. 准备工作（用品）
(1) 适当的包装细胞系及培养液。
(2) 大多数包装细胞系为鼠源的，含有鼠“Helpe病毒”，此病毒可帮助被去除某些功能结构基因的逆转录病毒复制，并包装于蛋白衣壳中。
(3) 逆转录病毒质粒DNA常构建成含有抗药基因neo新霉素基因的载体。
(4) Hepes-缓冲液（HeBs）
(5) 2mol/L CaCl2
(6) 含血清及不含血清培养液
(7) HeBs 15%甘油（HeBs/甘油）
(8) 800mg/L（100×聚凝胺）（肝素对抗物）
(9) 10%～15%DMSO
(10) 10cm、6cm培养皿
(11) 24孔、6孔培养板
(12) 克隆环
2. 操作步骤
(1) 转染前，10cm培养皿中接种大约10%～20%皿底面积的包装细胞。
(2) 将10μg含抗药基因的逆转录病毒质粒DNA加入0.5mL HeBs中，加入32μL 2mol/L CaCl2，轻振动，加盖30分钟，室温下培养45分钟，直到小的、模糊的兰色沉淀产生。
(3) 从包装细胞中弃去旧液，轻轻滴入HeBs-DNA沉淀于细胞培养皿中心，使细胞接触DNA20分钟，每10分钟轻轻摇动培养皿，使溶液均匀，加入10mL培养液，并于37℃放置4小时。
(4) 完全吸出培养液，逐滴加入2.5mL的HeBs/甘油，放回培养箱继续培养，如果使用的是ψ2/YCRE/YCRIP/PA317包装细胞系，需培养3.5分钟，若为Q2bn包装细胞系，需培养1.5分钟，或根据不同包装细胞选用不同时间。迅速弃去HeBs/甘油，用10mL培养液洗2次，加入含有血清的5ml培养液培养18～24小时。
(5) 取出培养液用0.45μm过滤，可获得含有短期产生病毒的培养上清，-70℃或-80℃贮存，或立即用于其它包装细胞系的感染。
(6) 加入10ml培养液于上述已感染的细胞，继续培养2～3天，继续步骤10。
(7) 另一包装细胞受感染前1：10或1：20传代。
(8) 倒去包装细胞的培养液，加入步骤5获得的病毒。方法如下：
对于10cm培养皿，将0.1至1.0mL病毒贮存液稀释至3～5mL的终体积，加入800mg/L聚凝胺至终浓度为8 mg/L，培养1小时以上。
(9) 若10cm培养皿加入10mL培养液，6mL培养皿中应加入4mL培养液，培养2～3天。
(10) 步骤6或步骤9得到的感染细胞，2～3天后按1：10或1：20传代，接种于选择培养液培养3天，更换培养液，继续培养3～4天，直至克隆出现。
(11) 用克隆环挑出分离的克隆，每个克隆接种24孔板或6孔板中的二个孔，生长至50～90%底部面积。
(12) 倒去培养液，换入1倍体积的培养液，继续培养1～3天，收取培养液，马上滴定，或者贮存于-70℃或-80℃。
(13) 继续传代克隆细胞直到能被冷冻或被鉴定，若病毒产生克隆被鉴定，10%～15%DMSO保护剂液氮冻存细胞。即产生病毒细胞系建立。
(二) 病毒滴度鉴定
在分离产生病毒的克隆后，需进行病毒滴度的测定，常用的方法是用病毒感染目的细胞，可根据载体RNA或蛋白的出现粗略定量分析。
1. 准备工作
(1) 病毒贮存液（步骤5所得）
(2) 目的细胞系（NIH3T3成纤维细胞）
(3) G418或其它选择**
2. 操作步骤
(1) 目的细胞系NIH3T3细胞在感染前**按1：10至1：20接种6cm培养皿。
(2) 感染当日，弃去目的细胞培养旧液，加入含病毒的贮存液（步骤5所得），用1～2ml含0.01～0.1病毒贮存液感染6cm培养皿目的细胞 （或者3～5ml用于10cm培养皿中的细胞），加入800 mg/L聚凝胺至终浓度为8 mg/L，培养1～3小时，37℃。
(3) 加入培养液，稀释聚凝胺至2 mg/L，再继续培养2～3个细胞周期（NIH3T3细胞周期为2～3天）。
(4) -a，如果病毒带有组化标记基因，如LacZ，用X-gal染色感染细胞。按步骤6计算蓝色克隆的数量以得到病毒的滴度。
(4) -b，如果病毒携带抗药基因，传代细胞应选择培养条件。如果抗药基因为neo，细胞按1：10至1：20传代，接种含有G418的两个 10cm（或6cm）培养皿中，培养3天。
(5) 更换培养液（含选择性G418**）共培养7-10天，此时克隆应该非常明显，计算克隆数。
(6) 滴度计算公式：
G418-RCFU（集落形成单位）/m=克隆数/病毒体积（mL）×复制因子X接种率
若为(4) -a中所叙，病毒携带LacZ，用X-gal染色细胞根据显示的克隆数，计算病毒的滴度，其公式为：X-gal CFU/mL=X-gal阴性克隆数/病毒体积（mL）
(7) 其它方法再鉴定产生病毒的克隆，细胞所产生的病毒基因无重新排列或缺失。
3. X-gal对感染细胞的染色方法（此方法可使该病毒感染细胞着色，可用于直接测量病毒滴度）
(1) 准备工作
除以上各种实验用品外，尚需：
① 带有LacZ编码病毒的转染（或感染）的细胞；
② 固定液：0.05%戊二醛或2%多聚甲醛；
③ X-gal染液。
(2) 操作步骤
① 倒去培养液，向感染细胞的皿中加入固定液（6cm皿加2mL，10cm皿加5mL），加2%多聚甲醛室温固定60分钟，或0.05%戊二醛固定 5～15分钟。
② 去除固定液，用PBS洗3次，**次洗涤时放置10分钟，**和末次洗涤时则快速。
③ 加入*小体积的X-gal溶液，盖住细胞37℃1小时或过夜，阳性细胞（病毒感染细胞）则成兰色。
原代培养正常上皮细胞的逆转录病毒转染
通过将病毒基因转染到上皮细胞中，使细胞可在体外无限生长，保持正常上皮细胞的特点。
(一) 准备工作
1. 产生病毒的细胞系，方法见上。
2. DMEM培养液
谷氨酰胺0.02μg/mL
胰岛素0.25μg/mL
转铁蛋白0.12μg/mL
葡萄糖67.5μg/mL
10%小牛血清
聚凝胺1μg/mL
氢化考的松0.02μg/mL
3. 丝裂霉素C、胰酶、6cm培养皿
(二) 操作步骤
1. 病毒产生细胞系暴露于丝裂霉素C（4 mg/L）2小时，洗干净后，胰酶消化，按5×106接种6cm培养皿，培养液为DMEM。
2. 待转染的原代培养正常上皮细胞接种于铺有以上细胞的培养皿中，培养3天。
3. 更换培养液，继续培养24小时。
4. 取50μL培养上清，进行病毒滴度检测，方法同前，9×103～7×104集落形成单位/mL可用于转染。
5. 正常上皮原代培养10天后，取贴在饲养层细胞的上皮细胞，保留至上皮细胞数生长量足够选择。
6. 在上皮细胞生长2～4周内，成活的克隆用克隆环挑出，再继续使用三轮有限稀释法建立单个细胞系克隆。
(三) 鉴定
按病毒所带有的抗药基因进行选择培养筛选，或其它方法鉴定转染细胞，方法见后。
(四) 注意事项
无论用什么方法将DNA导入细胞，暂时或稳定的转染率很大程度取决于细胞的类型。不同的细胞系对获取外源性DNA以及表达的能力相差几个数量级。此外，一种方法对一种培养细胞有效，但对另一种培养细胞可能无效。
