原代胚胎成纤维细胞(ME)的制备
1. 取12.5-13.5dpc孕鼠,断颈处死;
2. 将鼠腹面向上放置,70% 酒精润湿、**腹部(防止腹毛飞扬,污染内脏及**),剪开皮肤层、肌肉层,打开腹腔,将连接在**上的结缔组织及脂肪剪去,将**取出,转入无菌10cm平皿中;
3. 把平皿转入超净台;
4. 用镊子打开**壁,挤出鼠胚,并与胚外组织、胎盘等分离,除去鼠胚的头、四肢及各种内脏(主要为肝脏、肺脏、心脏和肠胃等);
5. 将鼠胚移入另一新的无菌皿,用PBS洗三次;
6. 弃去PBS,用弯头剪将鼠胚剪碎,加入PBS洗至溶液基本无色(1-4次);
7. 加入适量Trypsin-EDTA(0.25% Gibco 25520,下同),体积约等于组织块体积;上海创赛科技提供610769-35-2,Tris Borate EDTA buffer, for molecular biology, 10x, DNAse, RNAse and Protease free, pH 8.3 ,商品编号:C82-32733-1LT,价格763元。
8. 用滴管轻轻吹匀,室温下消化1-10分钟(或消化至溶液浑浊变粘),加入与消化液等体积培养基,轻轻吹打混匀(5-10次),静置;
9. 沉降后将上部溶液轻轻吸出,转入离心管中。
10. 将细胞悬液管离心(1000转5分钟);
11. 弃去上清,向沉淀中加入适量培养基,轻轻吹打重悬,将其分种至10 cm细胞培养皿,补加适量培养基,作标签(ME-0;注意:若冻存,则可以使用复苏后的0代ME制作Feeder;若直接使用则*好不用0代ME细胞做Feeder,要传到一代以后再用来制作Feeder比较好),转入培养箱培养;
12. 视细胞生长情况换液(一般3天换液一次),若细胞已长满,则冻存,或者1:3-5传代(视细胞疏密而定),放入培养箱继续培养(此后不用再换液);1-5代的ME细胞均可用来制作Feeder。
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