Western Blot已经成为实验室中检测蛋白质的常规手段。不过想要得到一张条带清晰、没有杂带、背景干净的图片,还是具有一定挑战性的。我们在做蛋白电泳和Western Blot时,多数都用的Bio-Rad公司的仪器和abcam公司抗体,所以Bio-Rad蛋白方面的技术专家的确可以称之为专家,因为每天都有很多人向他们请教。他们就将*常见的问题整理成《Western Blotting Troubleshooter》。我们节选了一部分,希望能帮你节省一些查资料的时间。
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A:背景过高可能是由很多因素引起的:封闭不完全、显色过度、洗涤不充分、转移缓冲液或设备有污染、抗体稀释度不对或抗体不纯。
封闭不完全 一抗或二抗只要结合到膜上,就会显色。为了避免非特异性的结合,应用封闭液孵育膜,使所有的空白位点都被封闭蛋白占有。NC膜推荐的封闭液是3%的明胶。在室温孵育1小时。明胶不能在4℃孵育,因为它会凝结。如果想要低温封闭的话,可以用3%的BSA。PVDF膜推荐的封闭液是5%的脱脂奶粉。脱脂奶粉不能与Bio-Rad生物素化的蛋白标准一起使用。脱脂奶粉浓度过高也可能会产生背景。生物通 www.ebiotrade.com
二抗不纯 没有交叉吸附过的二抗可能会与膜上的其他蛋白相互作用,产生杂带。
功率条件 转印过程中产生的热是与功率成正比的。我们都知道,功率是电压与电流的乘积。P="IE" 而电压、电流和电阻又满足这个等式:R="V/I。当缓冲液分解时,电阻下降。如果电压是恒定的,则电流上升。因此,功率上升,产生更多的热量。如果电流是恒定的,则电压和功率下降,使蛋白转移得更慢。
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