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根瘤农杆菌的感受态细胞制备？

问题：根瘤农杆菌的感受态细胞制备？

解答：可参考：

农杆菌感受态的制备和转化
http://tong.dxy.cn/experiment/430/431/432/14520.htm
农杆菌感受态细胞的制备和转化子的验证
http://tong.dxy.cn/experiment/430/431/432/14566.htm

另外还有一种三亲交配的方法，效率很高，操作简单。方法如下：

目的
将中间质粒从大肠杆菌导入根癌农杆菌。

平板涂布法
材料
（1）受体农杆菌LBA4404（Rif）等。
（2）起协调作用的大肠杆菌HB101（pRK2013）。
（3）共体菌，带有中间表达载体的大肠杆菌（Km等）。
操作
（1）接种受体农杆菌（如LBA4404）在含有100ug/ml利福霉素的MGL固体培养基上，28度培养，等单菌落长出后，挑取一个单菌落接种在液体培养基中，28度振荡培养。
（2）接踵含有“协助”质粒（如pRK2013）的大肠杆菌在固体LB培养基上，37度培养，等菌落长出后，挑选一个单菌落接种在液体培养基中，37度振荡培养。
（3）挑选带有中间载体（如pBI121）的大肠杆菌的单菌落在含有50ug/ml卡那霉素的液体LB培养基中37度振荡培养。
（4）三种菌生长到OD600为0.5左右时，等体积混匀，涂布于不含任何抗生素的MGL或YEP固体培养基上，28度过夜培养。
（5）用接种针将长出的菌落转接到含有100ug/ml利福霉素和50ug/ml的卡那霉素的固体YEP培养基上，28度培养3—4天，长出单菌落。
（6）将长出的单菌落再次转接到含有100ug/ml利福霉素和50ug/ml卡那霉素的YEP固体培养基上，28度培养。
说明
（1）结合过程需要三种细菌：①含有重组质粒的大肠杆菌供体菌；②含有游动质粒Prk2013的大肠杆菌“协助”（helper）菌；③根癌农杆菌受体菌。三种菌混合时，协助质粒Prk2013游动进入大肠杆菌内，提供游动（mob）和转移（tra）功能，把供体的重组这里里转移进根癌农杆菌内。该系统中重组的载体质粒需要带有一个特定的转移起始点（oirT）和活化位点（bom），以使协助质粒的tra和mob基因对它起作用，被驱动转移。
（2）三亲结合使用的受体根癌农杆菌一般带有染色体抗性标记，如抗利福平（Rif），供体质粒常带有抗Km，Sm，Tc或Ap标记，这样利用Rif+Km等选择转移接合子。
（3）受体农杆菌所含的Ti质粒应是解除武装的卸甲Ti质粒。

（创赛技术中心 canspecsci.com）

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