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PVDF膜上蛋白的可逆染色

PVDF膜上蛋白的可逆染色
来源：互联网        整理：Disun

Western杂交时，为确认蛋白是否转至PVDF膜上，可用下列方法对膜上蛋白进行可逆性染色。

1. 氨基黑染色

染液：0.5% Amido Black (w/v), 25% isopropanol (v/v) and 10%aceticacid.

染色：将PVDF膜置于染液中染色数钟，ddH2O 脱色。

2. 考马氏亮蓝染色

染液：0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250 (w/v) and 50%methanol(v/v)

脱色液：40% methanol (v/v) with 10% acetic acid (v/v)

染色：将PVDF膜置于染液中染色15 min.，脱色液脱色。

3．丽春红染色PONCEAU S
染液：0.2% W/V PONCEAU S IN TCA (3% V/V)
染色：将PVDF膜置于染液中染色5MIN
脱色：DDH2O 脱色
三、银染

PAGE胶上蛋白质的银染方法有数百种，其原理相似，具体步骤各不相同。银染为蛋白质的非特异性染色，呈“爆炸性”反应模式，用于蛋白定量时准确性差，但其敏感度高、简便易行，仍被广泛应用。下面列举的这三种方法为常用的双向电泳凝胶染色法，可与质谱兼容。其中方法1敏感性最高，方法3背景最低、对比度好。

1. Blam silver stainingprotocol(Modified)
程序
溶液
时间
固定
 
40%ETOH
10%HAC
1小时
 
漂洗
30%ETOH
2×20min
致敏
0.02%Na2S2O3
1min
漂洗
H2O
3×20Secs
染色
0.1%AgO3(预冷)
4℃，20mins
漂洗
 
H2O
H2O(更换盘子)
3×20Secs
1min
显色
 
3%Na2CO3
0.05%甲醛
 
 
漂洗
H2O
20Secs
中止
5%Hac
 
漂洗
H2O
3×10min
贮存
1%Hac,4℃
 

2. EMBL Silver Staining Protocol
程序
溶液
时间
固定
 
50%MeOH
5%HAc
20min
 
漂洗
H2O
2hr或过夜
致敏
0.02%Na2S2O3
1min
漂洗
H2O
2×1min
染色
0.1AgNO3 (预冷)
20min
漂洗
H2O
2×1min
显色
 
2%Na2CO3
0.04%甲醛　
 
中止
5% HAc
 
贮存
1% HAc，4℃
 

3. Vorum Silver Staining Protocol
程序
溶液
时间
固定
 
 
 
漂洗
 
致敏
 
漂洗
染色
 
 
漂洗
显色
 
 
中止
 
贮存
50%MeOH
12%HAc
0.05%甲醛
 
35%EtOH
 
0.02%Na2S2O3
 
H2O
0.2AgNO3
0.076%甲醛
H2O
6% Na2CO3
0.05%甲醛
0.0004%Na2S2O3
50%MeOH
12%HAc
1%HAc，4℃
2hr或过夜
 
 
 
3×20mins
 
2min
 
3×5mins
20min
 
3×5mins
 
 
 
5mins

注意事项：

1.应严格按照操作步骤进行；

2.显色前最好更换新染色盘；

3.显色时变为黄色或棕色后立即弃去，更换新鲜显色液，一般来说染一块胶应配制500ml染液。更换2-3次；

4.市售甲醛的浓度为37%；

5.三种方法均与质谱兼容，Blum法敏感性高，但背景呈淡黄色，EMBL法次之但背景较低，染色点较黑。Vorum相对不敏感，但背景清晰，信噪比高。
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