和野生动物一样,细胞也会从一个地方迁移到另一个地方。虽然细胞迁移的原因还不明确,但它有助于我们理解正常细胞发生、发展、分化、伤口**等过程,以及某些**,如癌症转移。细胞侵袭的一个特殊情况,就是细胞三维迁移。 从细胞水平上讲,细胞迁移和侵袭时往往会出现细胞粘着斑(整合素介导的细胞运动前缘的附着点)。借用粘着斑作为牵引点,细胞将自己拉向目的地。 为了研究控制这些过程的复杂信号,已经开发了多种细胞迁移检测方法,比如,测量从起始位置移动到结束位置的细胞的数量(也可以是动态测量)。四种主要的细胞迁移实验分别为:跨膜/ Boyden小室、细胞划痕实验、细胞隔离迁移实验(也称为二维细胞迁移实验或缺口封闭实验)和微流体技术。选择何种检测结束需要对这些检测方法有一定的了解,并且明确你需要什么样的数据。了却以下问题将有利于细胞迁移检测方法的选择。
什么时候该使用跨膜/Boyden小室?
跨膜/Boyden小室是*常用的细胞迁移检测方法,该方法始于20世纪60年代,以S.V.Boyden的名字命名,小室被中间的微孔滤膜(通常涂有细胞外基质蛋白)分隔成两个腔。通常是在细胞培养板空中放置一聚碳酸酯细胞培养嵌套,嵌套底部为滤膜。检测时将细胞放置在一个腔中(或种植在膜的一侧),在另一腔内添加趋化剂(或抑制剂)。 受趋化剂影响,细胞穿过膜中的小孔迁移,之后你就可以使用显微镜观察细胞迁移情况。该实验类型的优点在于,你可以使用贴壁细胞或悬浮细胞,并可以测试趋化梯度下的迁移情况。 该方法缺点是,趋化剂的浓度梯度是未知和可变的,而且该方法只能做终点观察,很难看到动态变化过程(虽然这种情况正在改进,下文将会提到)。同时,细胞迁移后的人工计数也是相当乏味的,各种迁移细胞标签技术也正在发展中。Cell Biolabs公司称,“我们在进行细胞标签时是非常谨慎的,以为标签后的细胞迁移属性有可能发生改变,从而导致错误结果。” Cell Biolabs公司的CytoSelect细胞迁移检测试剂盒(CytoSelect Cell Migration Assays)能够实现细胞自动技术,但并未使用细胞标签技术,而是在完成细胞迁移后使用荧光染料进行技术。
BD Biosciences公司提供了另一种自动计数的解决方案,使用一种特殊的膜用来分隔小室。该公司的FluoroBlok细胞培养嵌套(BD FluoroBlok Cell Culture Inserts)含有“轻紧”型膜结构,能够阻止490-700nn的光线穿透。因此,研究人员可以在底部小室检测荧光,而光线不会到达小室顶端。使用BD FluoroBlok系统,如果荧光标记的细胞穿过滤膜,就可以自动被底部的荧光读板系统或荧光显微镜读取。该方法能够用于动态观察细胞迁移状况,而不仅仅用于终点分析。
BD BioSciences公司利用其FluoroBlok技术,还提供了多种应用。比如,BD BioCoat™ Angiogenesis System: Endothelial Cell Migration,它涂有人纤维连接蛋白,用于检测内皮细胞的迁移状况。BD FluoroBlok Insert 系统经常用于肿瘤细胞、内皮细胞迁移和侵袭检测。
什么时候该使用细胞划痕实验?
细胞划痕实验又称伤口**实验,是指将细胞培养在培养皿或平板上,待细胞融合后在中央区域画一条线,这条线内的细胞被机械力去除掉了,然后将细胞继续培养,观察细胞向无细胞的划痕区域迁移的情况,来判断细胞的迁移能力。*近,一些公司比如Essen BioScience提供自动化的细胞划痕工具,以提高可重复性。该公司的CellPlayer迁移检测试剂盒( Essen’s CellPlayer™ Migration Assay)是96孔板划痕检测系统。该板的优势在于使用简单,可以实时记录细胞迁移情况。但由于不同实验室可能会使用不同的划痕实验方法,而且即使使用自动设备也难以难以**控制划痕区域,因此实验组和对照组的划痕可能一致。
划痕还可能会损坏细胞下的细胞外基质。EMD Millipore公司指出,划痕实验在研究细胞骨架结构和细胞极性时十分有用,但由于使用的器具并不统一,因此其中的可变因素较多。比如,划痕的大小和宽度不一致,从而影响实验结果的可重复性和一致性。而且,划痕边缘的细胞可能会受到损伤,从而导致迁移困难。另一方面,划痕实验无法进行可溶性因子和化学趋化剂的梯度研究。损伤的细胞可能会释放某些物质进入培养基中,从而影响其他细胞。
什么时候该使用细胞隔离迁移实验?
细胞隔离迁移实验和划痕实验类似,检测细胞迁移进入无细胞区域的状况,只是不会出现划痕实验中的“伤口”(细胞刮伤)。细胞在培养孔底部生长,其周围放置抑制细胞在某个区域生长的物质,比如在培养孔中间放置小塞子,以产出无细胞区域。实验开始时移除小塞子,研究人员就可以观察细胞迁移至无细胞区域。该方法的优点是可以连续地观察细胞运动,不存在细胞损伤,而且研究人员可以添加某些基质,观察细胞的三维迁移。其缺点包括不能观察悬浮细胞或趋化梯度(Boyden小室可以测定)。
Platypus Technologies和Cell Biolabs公司使用多孔板用于细胞隔离迁移检测。Platypus*近推出高通量的兼容性检测方案,可以通过显微镜或高内涵的成像仪器读取数据。Platypus公司指出,“我们*近推出的ORIS Pro 384孔细胞迁移检测试剂盒完全实现自动化,既有适合组织培养处理的表面,也有I型胶原蛋白处理的表面。ORIS Pro 384是对96孔和小塞为基础的检测方式的改进,配合其高度自动化配置,尤其适用于高通量筛选。ORIS Pro 384在培养孔底部放置生物相容性凝胶,不需要提前放置小塞,也不需要使用**或手工移除小塞。随着高内涵分析仪器和多参数的读数仪器的到来,研究人员可以观察细胞的表型。”
什么时候需要微流体检测?
基于微流体设备的细胞迁移检测也日益普及。设备间的区别在于它们的构造的,但一般微流体设备都含有一连接两端的通道。研究人员可在一端加入,细胞可在底部生长。然后在另一侧加入趋化剂,使用显微镜观察细胞迁移状况。微流体检测的优点在于,研究人员可以节约宝贵的试剂和细胞(昂贵的**或罕见的原代细胞),研究人员还能够产生线性浓度梯度(和Boyden小室相反)。其缺点为由于体积较小,为保持细胞活性,可能需要频繁换液。
EMD Millipore公司*近公布了一种微流体迁移实验盒,该产品可单独使用,或和该公司的Boyden Chamber QCM™迁移和入侵检测试剂盒配合使用。 “我们公司*近推出的Millicell μ-migration Assay Kit,该产品可实时观察单细胞迁移情况。能够测量参数,如细胞的移动速度、方向和迁移指数等,该产品支持稳定的线性浓度梯度,持续时间超过48小时。因此,研究人员可以区分趋化和随机运动下细胞的慢速和快速迁移细。该试剂盒还可以使用荧光标记的细胞。”
“六月,EMD Millipore公司将公布QCM Invadopodia检测试剂盒,该产品含有癌变物质invadopodia,可引发肿瘤细胞迁移,它是**个也是目前**一个能可视化定量检测各种分子对ECM降解作用的试剂盒。该试剂盒可在玻璃培养表面形成一层薄膜,相容性试剂能将肌动蛋白、细胞核和invadopodial退化位点共定位,可用于检测invadopodia抑制剂和增强剂的活性,从而分析各种细胞类型的侵袭能力。该试剂盒有红色和绿色两种颜色可供选择。
Platypus公司指出,“由于许多研究人员都在研究**机制,细胞迁移检测产品也应该更接近生理状态。三维的细胞迁移检测可能更接近生理状态。同时,细胞在不同的培养表面上可能会产生不同的信号,细胞表面可能一部分和基质接触,而另一部分和培养液接触。我们的细胞迁移产品更倾向于将细胞的所有部分都埋入基质中。我们还需要不断地研究,以期开发成更多的检测模型。”