Western Blot中的三大常见问题

A：导致这种结果的因素很多。
    胶和膜放反了 如果在转印的过程中，胶和膜的位置颠倒了，那么蛋白就从胶上转移到缓冲液中，而不会到达膜上。对于标准的转印，凝胶应靠近三明治的负极，而膜对应正极。
    转膜效率低 转膜效率受多种因素影响，包括蛋白的大小、凝胶中丙烯酰胺的百分比、电场强度、转印时间和缓冲液的pH值。一般说来，蛋白越大，转移得越慢。转移大蛋白*好的方法是用高的电场强度。而小蛋白长时间处于高电场强度下可能会穿出转印膜。避免这个问题的方法是用0.2 um孔径的NC膜或PVDF膜进行转印。如果蛋白的等电点接近缓冲液的pH值，那么这个蛋白携带的电荷很少，在电场中也几乎不移动。如果你的目的蛋白是强碱性的，那么你可以用碳酸盐（pH9.9）、CAPS（pH11）及酸性缓冲液。
    在转印之后，你可以通过染胶或**块膜来判断转印效率。为了帮助你直接监控转印效率，Bio-Rad也提供了多种预染Marker，它们在电泳以及转膜之后可直接观察到。试剂放置太久或存放条件不正确 抗体会慢慢降解，如果反复冻融的话，它会快速降解。底物应储存在-20°C。
    抗体不纯或滴度太低 一抗的浓度差异很大，应该根据经验来决定一抗的稀释度。过犹不及，太多的抗体也会阻碍抗原与抗体的结合。一般的原则是以1:100-1:1000来稀释血清或组织培养上清，以1:1000-1:10000来稀释腹水或超**动物的血清。Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是1:3000。
    酶失活了 叠氮钠是辣根过氧化物酶的抑制剂。不要在HRP显色的western blot中使用任何含叠氮钠的试剂。叠氮钠可以用于碱性磷酸酶结合的抗体中，而无副作用。另外，自来水或用聚苯乙烯树脂去离子的水也可能会使酶失活，只能使用蒸馏的去离子水。
    使用Tween-20洗涤 Tween-20（吐温-20）可能会干扰某些抗体-抗体相互作用，或洗走NC膜上的目的蛋白。尽管在洗涤时它的终浓度只有0.05%-0.1%，但仍可能会影响结合。因此除了封闭之后的**次洗涤，其他洗涤过程中都不使用Tween-20，不过，这可能会使背景升高。
    检测系统缺乏足够的灵敏度   确保蛋白的上样量在检测系统的灵敏度范围内：
    辣根过氧化物酶                500 pg/band
    碱性磷酸酶                    100 pg/band
    增强的碱性磷酸酶              5 pg/band
    胶体金                        100 pg/band 
    增强的胶体金                  10 pg/band
    Immun-Star 化学发光           10 pg/band
Q：我的western blot总是背景过高，如何解决？

A：背景过高可能是由很多因素引起的：封闭不完全、显色过度、洗涤不充分、转移缓冲液或设备有污染、抗体稀释度不对或抗体不纯。

    封闭不完全 一抗或二抗只要结合到膜上，就会显色。为了避免非特异性的结合，应用封闭液孵育膜，使所有的空白位点都被封闭蛋白占有。NC膜推荐的封闭液是3%的明胶。在室温孵育1小时。明胶不能在4℃孵育，因为它会凝结。如果想要低温封闭的话，可以用3%的BSA。PVDF膜推荐的封闭液是5%的脱脂奶粉。脱脂奶粉不能与Bio-Rad生物素化的蛋白标准一起使用。脱脂奶粉浓度过高也可能会产生背景。生物通 www.ebiotrade.com